三斑海马及其混伪品的DNA条形码分子鉴定研究

《中国药典》2015 年版记录并收载 5 个品种的 海马药材：三斑海马 Hippocampus trimaculatus Leach、线纹海马 Hippocampus kelloggi Jorden et Snyder、大海马 Hippocampus kuda Bleeker、刺海马 Hippocampus histrix Kaup 和小海马（海蛆） Hippocampus japonicus Kaup 的干燥体，有散结消 肿、温肾壮阳等功效。三斑海马（俗名龙落子）， 隶属我国国家二级保护动物，通常栖息在 1～100 公尺左右的具海藻床的礁石区中，也可生长在河海 交界处，喜食活饵，糠虾、毛虾、磷虾、萤虾等小 型浮游甲壳动物是其主要食物来源，其体色艳丽， 无毒，具有良好的观赏价值。

1 材料与仪器 

1.1 材料 

共收集海马药材样品 13 份，分别购自 浙江磐安以及安徽亳州药材市场，包括三斑海马样 品 12 份，宝珈海龙样品 1 份，经浙江中医药大学 第一临床医学院葛宇清副研究员鉴定为三斑海马 Hippocampus trimaculatus Leach 和宝珈海龙 Doryichthys boaja Bleeker。将所用样品做好标记， 于干燥封口袋中避光保存，样品保存于浙江中医药 大学药学院。同时在 GenBank 数据库中下载 20 条 COI、16 S 和 ATP6 序列（线纹海马 H. kelloggi Jorden et Snyder 3 条，大海马 H. kuda Bleeker 2 条，小海 马 H. mohnikei Bleeker 3 条，刺海马 H. histrix Kaup 2 条，太平洋海马 H. ingens Girard 2 条，直立海马 H. erectus Perry 2 条，虎尾海马 H. comes Cantor 2 条，棘海马 H. spinosissimus Weber 3 条，拟海龙 Syngnathoides biaculeatus Bloch 1 条）。 

1.2 试剂 

无水乙醇（上海凌峰化学试剂有限公司）；海 洋动物组织基因组 DNA 提取试剂盒（天根生化 科技有限公司）；琼脂糖粉（BIOWEST）；50×TAE 缓冲液[生工生物工程（上海）股份有限公司]； DL2000 DNA Marker（TaRaKa 公司）；6×Loading Buffer（TaRaKa 公司，）；4S Green 染料（BBI Life Sciences）；10×PCR buffer（TaRaKa 公司）；dNTP Mix（TaRaKa 公司）；rTaq 酶（TaRaKa 公司）； COI、16 S rRNA 和 ATP 引物由上海桑尼生物科 技有限公司合成。

1.3 主要仪器设备 

电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公 司]；电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）； 超微量分光光度计（美国 Thermo 公司）；鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；微波炉 （格兰仕微波生活电器有限公司）；S1000TM Thermal Cycler（美国 Bio-rad 公司）；凝胶电泳仪（美国 Bio-rad 公司）；凝胶成像系统（美国 Bio-rad 公司）； 离心机（杭州宝诚生物技术有限公司）。