发酵食品抗氧化乳酸菌的筛选(博迅SPX-250B-Z使用

１９５６年 英 国 学 者 Ｈａｒｍｎａ首 先 提 出 了 自 由 基 衰老学说。自由基衰老理论（ＦＲＴＡ）认为细胞的老化变化是由自由基反应引起的。１９９０年 美 国 衰 老研究权威Ｓｏｈａｌ教授指出了自由基衰老理论的缺陷，并首次提出了氧化应激的概念。氧化 应 激 即 机体自由基生成增加或清除能力降低，引起机体氧 化系统和抗氧化系统的功能紊乱，导致自由基在体 内积累而引起的一系列氧化损伤过程。多种研究 证明：氧化应激不仅与衰老有着密不可分的关系，氧 化应激还与肿瘤的发生，哮喘、抑郁症及各种慢性炎 症等疾病息息相关。氧化应激还 参 与 心 血 管 疾 病的病理生理过程，引发动脉粥样硬化、心力衰竭、 高血压和心肌损伤等。

１ 材料与方法

１．１ 材料与仪器

传统自制的发酵蔬菜：萝卜、白菜、长豇 豆 和 芥 菜；婴儿粪便，采 集 于２５ｄ健 康 婴 儿；ＭＲＳ液 体 培 养基：蛋白 胨 １０．０ｇ／Ｌ，牛 肉 膏 １０．０ｇ／Ｌ，酵 母 膏 １０．０ｇ／Ｌ，柠檬酸二铵２．０ｇ／Ｌ，乙酸钠５．０ｇ／Ｌ，硫酸镁０．５８ｇ／Ｌ，硫 酸 锰０．２５ｇ／Ｌ，磷 酸 氢 二 铵２．０ ｇ／Ｌ，葡萄糖２０．０ｇ／Ｌ，吐 温－８０１ｍＬ；二 苯 基 苦 基 苯肼自由基（Ｓｉｇｍａ生物试剂有限公司）；ＤＮＡ 抽提 试剂盒，由生工生物工程（上海）股份有限公司出品； ＡＰＩ５０试剂条（生物梅里埃中国有限公司）；邻菲罗 琳、过氧化氢、硫酸亚铁和抗坏血酸等试剂（均为国 产分析纯）。 生化培养箱（型 号 博迅SPX-250B-Z，上 海 博 迅 实 业 有限公司）；紫 外／可 见 分 光 光 度 计（型 号 ＵＶ１０００， 上海天美科学仪器有限公司）；超声波破碎仪（ＳＯＮ－ ＩＣＳ，型号 ＶＣＸ５００）；台式高速冷冻离心机（Ｔｈｅｒ－ ｍｏ，型号Ｓｔｒａｔｏｓ）；聚合酶反应 仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，型 号 Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ）。

１．２ 实验方法

１．２．１ 样品的采集

使用一次性无菌注射器采集发酵蔬菜的汤汁， 保存于已灭菌的 ＥＰ管中。对婴儿粪便进行无菌采 集，采样后样品封口膜封口，均保存于４ ℃备用。

１．２．２ 乳酸菌的分离纯化

将样品用生理盐水进行梯度稀释，将稀释后的 样品均匀涂布于ｐＨ 为５．０的 ＭＲＳ固体培养基上， 放入３７ ℃普通培养箱培养２４～４８ｈ。 观察菌落形态，挑选符合乳酸菌形态的菌落进 行３次划线纯化。对纯化后的菌落进行革兰氏染色 和接触酶实验。革兰氏染色阳性，接触酶实验为阴 性的菌株可初步判定为乳酸菌。

１．２．３ 乳酸菌耐受性实验

１）乳酸菌的耐酸性测定：将活化后的菌株，以 ３％的接种量分 别 接 种 于 ｐＨ 为２．０，３．０，４．０，６．０ 的 ＭＲＳ液体培养基中，３７ ℃培养１６ｈ。１６ｈ后测 其在６００ｎｍ 处的吸光值。
２）乳 酸 菌 的 胆 盐 耐 受 能 力 测 定：将 活 化 的 菌 株，以３％的接种量接种于分别含有０，０．３％，０．５％ 猪胆盐的 ＭＲＳ液体培养基中，３７ ℃培养１６ｈ。１６ ｈ后测其在６００ｎｍ 处的吸光值。
３）乳酸菌的过氧化氢耐受能力测定：将活化的 菌株按３％接 种 于 过 氧 化 氢 浓 度 分 别 为 ０．４，０．７， １．０ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭＲＳ液 体 培 养 基 中，３７ ℃培 养１６ ｈ。１６ｈ后测其在６００ｎｍ 处的吸光值。

１．２．４ 乳酸菌体外抗氧化能力测定

１）样品的处理 样品处理 参 考 Ｌｉｎ等的 方 法。完 整 细 胞 悬 液：将菌以１％接种于 ＭＲＳ液体培养基，３７ ℃培养 １６ｈ后４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，收集 菌体，收集的菌体经 ＰＢＳ（ｐＨ 为７．
２）洗涤３ 次，再悬浮于 ＰＢＳ中，调整菌数至１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ。 胞内提 取 物：将 上 述 菌 数 为１×１０９ ｃｆｕ／ｍＬ 的 完整细胞悬液激进行超声破碎，功率４００ Ｗ，工作５ ｓ，停５ｓ，６０ 次。破碎后将悬液４ ℃，１００００ｒ／ｍｉｎ 离心１０ｍｉｎ，收集上清。 ２）ＤＰＰＨ 清除能力测定 取０．２ｍｍｏｌ／ｍＬ 的 ＤＰＰＨ１ｍＬ，加１ｍＬ 处 理过 的 乳 酸 菌 样 品 充 分 混 匀 后，室 温 避 光 反 应 ３０ ｍｉｎ，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清，测定其在波 长５１７ｎｍ 处 的 吸 光 度 Ａｉ，对 照 组（ＡＯ ）以 等 体 积 ＰＢＳ 代 替 样 品。 以 等 体 积 ＰＢＳ 和 无 水 乙 醇 调 ０，其表达式为 清除率＝ＡＯ－Ａｉ ＡＯ ×１００％ ３）羟自由基清除能力测定 取１ｍＬ的邻菲罗琳（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），加入 ＰＢＳ １ｍＬ，蒸馏水１ｍＬ，充分混匀后加入１ｍＬ 硫酸亚 铁（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），再次充分混匀，加１ｍＬ过氧化氢 （浓度为２０ｍｍｏｌ／Ｌ）。将上述反应液于３７ ℃水浴 １．５ｈ后在５３６ｎｍ 处测定其吸光度 Ａｐ；用１ｍＬ蒸 馏水代替过氧 化 氢 为 Ａｂ；用１ｍＬ 样 品 代 替１ｍＬ 蒸馏水为Ａｓ ，其表达式为 羟自由基清除率＝Ａｓ－Ａｐ Ａｂ－Ａｐ ×１００％ ４）抗脂质过氧化能力测定 在新鲜的鸡蛋黄中１︰１加入 ＰＢＳ，磁力搅拌 １０ｍｉｎ后用 ＰＢＳ稀释成１︰２５的蛋黄悬液。取１ ｍＬ蛋 黄 悬 液，０．５ ｍＬ 样 品，１ ｍＬ ＰＢＳ 和 １ ｍＬ ＦｅＳＯ４（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液混匀，３７℃保温１．５ｈ。然 后加入１ｍＬ三氯乙酸（ＴＣＡ，质量分数为２．５％）， 室温静置１０ｍｉｎ，３５００ｒ／ｍｉｎ，离 心１０ｍｉｎ。取 上 清加入２ｍＬ 的 硫 代 巴 比 妥 酸（ＴＢＡ，质 量 分 数 为 ０．８％），充 分 混 匀 后 沸 水 浴 １０ ｍｉｎ；冷 却 后 于 ５３２ ｎｍ 处测定 吸 光 度 Ａ１。Ａ０ 用等量的样品溶剂（即 ＰＢＳ）代替样品，其表达式为 脂质过氧化抑制率＝Ａ０－Ａ１ Ａ０ ×１００％ ５）还原活性分析 在０．５ｍＬ的菌悬液中依次加入０．５ｍＬＰＢＳ， ０．５ｍＬ铁氰化 钾（质 量 分 数 为１％），５０ ℃水 浴２０ ｍｉｎ，迅 速 冷 却 后 加 入 ０．５ ｍＬ１０％ 的 三 氯 乙 酸， ４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。取 上 清１ｍＬ 加 入１ｍＬ 蒸馏水和三氯 化 铁（质 量 分 数 为０．１％）混 合 均 匀， 反应１０ｍｉｎ后于７００ｎｍ 处测定其吸光值，用 Ｌ－半 胱氨酸作为标品。

１．２．５ 菌种鉴定

１）１６ＳｒＤＮＡ：将乳酸菌ＺＪ４０１过夜培养后，取适 量菌液利用试剂盒提取全基因组。得到的全基因组用 １６Ｓ通用引物进行ＰＣＲ（２７Ｆ：５＇－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧ－ ＧＣＴＣＡＧ－３＇；１４９２Ｒ：５＇－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－ ３＇），将 ＰＣＲ 产物送至公司进行测序。将测序结果在 ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴ比对。 ２）ＡＰＩ５０ＣＨ菌种鉴定：用 ＡＰＩ５０ＣＨ及 ＡＰＩ５０ＣＨＬ 进行乳酸菌的生理生化鉴定，操作步骤按照说明书进行。 ３）生长曲线分析：取５０ｍＬ 已发酵２４ｈ的菌 液离心弃上清，用生理盐水洗涤后再离心弃上清，置 于烘箱中烘干至恒重（６５ ℃，２４ｈ），测其干重，以此 为依据分别计算出１，２，４，５，６，８，１０ｍＬ发酵液 的菌体干重。另取１，２，４，５，６，８，１０ｍＬ菌液， 离心弃上清后用生理盐水重悬浮混 匀定容至 ２５ ｍＬ，分别测其 ＯＤ６００ｎｍ，得到吸光值 ＯＤ６００ｎｍ与菌体 干重的生物量标准曲线。另以１％的接种量将乳酸 菌ＺＪ４０１接种于 ＭＲＳ液体培养基中，每隔２ｈ取一 定量菌液进行ＯＤ６００ｎｍ测定和ｐＨ 测定。

１．２．６ 统计分析

每个实验重复３ 次，采用 ＳＰＳＳ１９．０的单因素 方差分析显著性差异。

２ 结果与讨论

芬顿反应是过氧化氢和二价铁离子催化反应 生成具有强氧化能力的羟基自 由 基，目 前 芬 顿 反 正也广泛应用于抗氧化能力的评价实验中。乳酸菌要顺利到达肠道，除了需要具有一定的耐 酸能力以外，还需要具有一定的胆盐耐受能力，正常人 体肠道中胆盐质量分数在０．０３％～０．３％波动，乳酸菌 在此胆盐浓度下具有活性就有可能在肠道中定植。ＤＰＰＨ（１，１－二 苯 基－２－三 硝 基 苯 肼）自 由 基 清 除实验常用于抗氧化能力的评价实验中。当 自 由 基 清 除 剂 存 在 时，ＤＰＰＨ 自由基接受一个 电子或 氢原子，形成稳定的 ＤＰＰＨ－Ｈ 化合物，使 其 乙 醇 溶 液从深紫 色 变 为 黄 色，变色程度与其 接受的电子 数量（自由基清 除 活 性）成 定 量 关 系，因 而 可 用 分 光光度计进行快速的定量分析。

３ 结 论

随着科技进步和生活水平的提高，细胞抗氧化 与抗衰老越来越多地为人们所关注。细胞氧化应激 损伤与衰老及多种疾病都有着密不可分的关系。本 实验从各种发酵食品中筛选得到３４株乳酸菌，经耐 酸耐胆盐及耐过氧化氢实验得到６株耐受性较好的 乳酸菌，通过 ＤＰＰＨ 清除率，羟自由清除率，还原活 性，抗脂质过氧化率实验对菌株的体外抗氧化性进行了鉴定，确定了一株具有优良抗氧化性的短乳杆 菌，命名为ＺＪ４０１。ＺＪ４０１具备优良的体外抗氧化活 性和益生性能，为后续乳酸菌的菌种选育，食品发酵 工业中功能性抗氧化食品发酵剂的研制，以及新型 的益生活菌制剂的开发奠定基础。

 

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