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细胞增殖和凋亡的影响及其机制(博迅细胞培养箱

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-13 09:59【

微小 RNAs (miRNAs)是一 类 由 18~25nt 组成的非编码 RNA,可通过直接与靶基因的3′端 非翻译区 (3′-UTR)相互作用调控靶基因的表达, 参与细胞的增殖、分化和凋亡等生物过程,与包括 食管癌在内的多种疾病的发生发展有密切关联。 miR-302b-3p被证实在食管癌组织中表达下调,不 仅可通过靶 向 ERBB4、Irf2和 CXCR 参与 调 控 食 管癌的炎症反应,还可通过靶向 ERBB4诱导癌细 胞凋亡和抑制细胞增殖;然而其 调 控 食 管 癌 细 胞增殖和凋亡的分子机制尚未见报道。上皮细胞转 化序 列 2 (epithelialcelltransformationsequence 2,ECT2)基因被证实是一种重要的致癌基因,在 乳腺癌和肺腺癌等细胞增殖和凋亡过程中发挥重要作用。


1 材料与方法 


1.1 细胞、主 要 试 剂 和 仪 器


 人 食 管 癌 EC-109 细 胞和人正常食管上皮 HET-1A 细 胞 (美 国 ATCC公司)。胎牛血清 (兰州民海生物工程有限 公司),RPMI-1640 培 养 基 (美 国 Gibco 公 司), 胰 蛋 白 酶、 二 甲 基 亚 枫、 噻 唑 蓝 (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT) 试 剂 (美 国 Sigma 公 司 ),miR-302b-3p mimics/inhibitor及其 阴 性 对 照 片 段 (江 苏 百 奥 迈 科 生 物 技 术 公 司), 青 链 霉 双 抗 混 合 液 (美 国 Gemini公司),细 胞 周 期 蛋 白 D1 (CyclinD1)抗 体、细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 2 (recombinant cyclindependentkinase1,CDK2) 抗 体、ECT2 抗 体、Bcl-2 相 关 X 蛋 白 (Bcl-2 associated X protein,Bax)抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨 酸 蛋 白 水 解 酶 3 (Cleaved cysteinylaspartate specificproteinase-3,Cleaved caspase-3) 抗 体、 β肌动 蛋 白 (β-actin) 抗 体 (武 汉 博 士 德 生 物 公司 ), 硝 酸 纤 维 素 膜 (nitrocellulose filter membrane,NC)(美国 Pierce公司),辣根过氧化 酶标记的二抗 (北京中杉金桥生物有限公司),报 告基因表达 载 体 (美 国 Ambion公司),二喹 啉 甲 酸 (bicinchoninicacid,BCA)蛋白 浓 度 测 定 试 剂 盒、电 化 学 发 生 (electrochemicalluminescence, ECL)试 剂 盒 (上 海 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ), LipofectamineTM 2000、实时荧光定量 PCR试剂盒、 cDNA 合 成 试 剂 盒 (美 国 Invitrogen 公 司 ), TRIzol总 RNA 抽提 试 剂 盒 (北京百泰克生物公 司),双荧 光 素 酶 检 测 试 剂 盒 (美 国 Promega公 司),细胞凋亡检测试剂盒 (美国 BD 公司)。流式 细胞仪 (美 国 BD 公司),PCR 扩增 仪 (美 国 MJ 公司),UVP 凝胶图象分析仪 (英国 GeneGenius 公司),CO2 细胞培养箱 (上海博迅医疗仪器有限 公司)。 


1.2 细胞培养


 采用含有10%胎牛血清和双抗的 RPMI-1640培养基于体积分数为5%CO2、温度为 37℃、饱 和 湿度细胞培养箱中培养 EC-109 和 HET-1A 细胞。每隔2d更换新鲜培养液。待细胞 铺满瓶底 时,以0.25%胰蛋 白 酶 消 化 传 代。收 集 生长良好的对数生长期细胞进行实验。 


1.3 细胞 分 组 和 转 染 


将 EC-109细胞 分 为 空 白 对照组 (未转染)、miR-NC组 (转染 miR-302b-3p mimics阴 性 对 照)、miR-302b-3p 组 (转 染 miR- 302b-3p mimics)、anti-miR-NC 组 (转 染 miR- 302b-3pinhibitor阴 性 对 照) 和 anti-miR-302b-3p 组 (转染 miR-302b-3pinhibitor),每组 设 3 个 复 孔。将 EC-109细胞以每孔500μL (约3×106 个) 接种至6孔细胞板上,培养箱内培养过夜。待细胞 贴壁生长 约 为75%融合 时,参 照 LipofectamineTM 2000说明书步骤将配制的脂质体 miRNA 混合物按 照实验分组加入到 EC-109细胞中。转染6h后更 换含胎牛 血 清 的 新 鲜 培 养 基。继 续 培 养 48h 后, 收集各组细胞进行后续实验。 


1.4 实时荧光定量


 PCR 法检测 HET-1A 细胞和 EC-109细胞 中 miR-302b-3p表达 水 平 收 集 未 转 染的 HET-1A 细胞、EC-109细胞和转染48h的各 组 EC-109细胞,采用 TRIzol法提 取 总 RNA,采 用分 光 光 度 计 测 定 RNA 的浓度和完整性。参照 cDNA 合成试剂 盒 说 明 书 步 骤 反 转 录 合 成cDNA。 以cDNA 为模板进行 PCR扩增。20μL反应体系: 2μLcDNA, 加 入 10μL2× 定 量 PCR Master Mix、各 0.08 μL 上 下 游 引 物 (摩 尔 浓 度 为20μmol·L-1)、0.4 μL Taq DNA 聚 合 酶 (2.5U·μL-1)和 6μLddH2O。PCR 反 应 体 系: 95 ℃ 预 变 性 3 min,95 ℃ 变 性30s、60 ℃ 复 性 30s,72℃延伸30s,共40个循环。miR-302b-3p 引物:F5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′,R5′- TGCTTAAGTGCTTCCATGTT-3′; U6 引 物: F5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′, R5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。 以 U6 为内参,采 用 2-△△Ct法 计 算 miR-302b-3p 的 相 对 表达水平。实验重复3次。 1.5 MTT 法 检 测 各 组 EC-109 细 胞 活 性 以 1000r·min-1离心 5 min 后收 集 各 组 EC-109 细 胞,调整细胞浓度为2×104 mL-1。以每孔100μL 平铺于96孔细胞板上,每组设3个平行孔。置于 细胞 培 养 箱 内 常 规 培 养,分 别 在 培 养 24、48 和 72h后向每孔中加入10μL MTT (5g·L-1)溶 液孵育4h,并以100μL二甲基亚砜溶解 MTT 结 晶。采用酶标仪在450nm 波长处检测各组细胞的 吸光度 (A)值,重复测量3次,取 A 值平均值表 示各组细胞活性。


2 结 果


食管癌 EC-109细胞中 miR-302b-3p的表达水平 (1.00±0.06)明显低于正常食管癌上皮 HET-1A 细胞 (0.26±0.28) (t=4.476,P=0.011)。与 空白 对 照 组 比 较,miR-NC 组 和 anti-miR-NC 组 EC-109细胞 中 miR-302b-3p的表达水平差异无统 计学意义 (P>0.05);miR-302b-3p组 EC-109细 胞中 miR-302b-3p的表达水平较 miR-NC组明显升 高 (P<0.05),anti-miR-302b-3p组 EC-109细胞 中 miR-302b-3p表达水平较anti-miR-NC组明显降 低 (P<0.05)。见


3 讨 论


 肿瘤发生发展过程中往往伴随着某些 miRNAs 的异 常 表 达,而 这 些 miRNAs在 肿 瘤 细 胞 增 殖、 侵袭、转移和凋亡过程中发挥重要作用;其中, 作为 miR-302 基 因 簇 家 族 中 的 重 要 代 表,miR- 302b在多种肿瘤的进程中扮演着重要角色。miR- 302b-3p在胃癌组织和细胞中表达水平下调,上调 其 表 达 可 通 过 靶 向 胰 岛 素 样 生 长 因 子 1 受 体 (insulin-likegrowthfactor-1receptor,IGF-1R)抑制 AKT 信 号 通 路 的 激 活,影响周期相关蛋白 CyclinA2、CyclinD1、CDK2、CDK6 和 凋 亡 蛋 白 Bax、Bcl-2的表 达 发 挥 抑 制 细 胞 增 殖、细 胞 周 期 G1→S转化并诱导细胞凋亡的作用。同时,miR- 302b 还 可 通 过 靶 向 调 控 EphA2 减 弱 Wnt/ β-catenin/EMT 信号 级 联 通 路 抑 制 胃 癌 细 胞 的 增 殖、侵 袭 和 迁 移。在 恶 性 胸 膜 间 皮 瘤 细 胞 中, miR-302b通过靶向 Mcl-1抑制肿瘤细胞的增殖并 诱导细 胞 凋 亡。肝 癌 组 织 中 miR-302b 表 达 降 低,miR-302b过表 达 可 通 过 直 接 靶 向 Akt2 减弱 NF-κB和 MMP-2 的 表 达 抑 制 癌 细 胞 的 侵 袭 和 转 移。此外,miR-302b还可 通 过 靶 向 调 控 E2F1 增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性,降 低 细 胞 活 性。可见,miR-302b可通过调控多种靶基因或 途径调控肿瘤的发生发展。






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