博迅培养箱在次级代谢潜力评估中的使用

多药耐药病原菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐青 霉素肺炎链球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP）、耐多药结核分枝杆菌（multiple drugs resistant tuberculosis，MDR-TB）等革兰氏阳性菌和耐碳青霉烯类鲍 曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii， CRAB）、超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）肠杆菌等革兰氏阴性菌，其介导的感染性疾病是当今世界需要亟待解决的健康安全问题。

土样：32份试验土样采集于贵州遵义凤凰山公园（10份）、 赤水丹霞山（12份）、大板水国家森林公园（10份）周边人员 活动较少地区、海拔500～1 000 m左右的除地表腐殖质 10～20 cm的土层，分装于无菌样品采集袋中常温保存运输。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）31：由本实验室保藏。

改良高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1 g，K2HPO4 ·3H2O 0.5 g，MgSO4 ·7H2O 0.5 g，FeSO4 ·7H2O 0.01 g，玉米汁50 mL，土壤浸出物50 mL，土壤样品细粉 10 g，复合维生素浸提物10 mL，琼脂18 g，蒸馏水1 L，pH 7.2，115 ℃高压灭菌30 min。其中玉米汁的制备：称取新鲜 的玉米100 g，加入1 L蒸馏水，用豆浆机搅拌均匀后，滤掉 废渣，补加蒸馏水至2 L，经微孔滤膜过滤除菌后于4 ℃冰 箱保存备用；复合维生素浸提物的制备：取21金维他多维 元素片20片（0.825 g/片）研磨成粉，入15 mL无水乙醇和35 mL无菌水振荡悬浮，8 000 r/min离心10 min，上清用微 孔滤膜过滤除菌后于4 ℃冰箱保存备用。 土壤浸汁腐殖酸培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g， 微量元素预混液（ZnSO4 ·7H2O 2 g/L，FeSO4 ·7H2O 2 g/L， MnCl·2 4H2O 2 g/L，CuSO·4 5H2O 2 g/L，Na2B4O·7 10H2O 2 g/L， （NH4 ）6Mo7O2·4 4H2O 2 g/L）0.5 mL，腐殖酸2.0 g，琼脂18 g， 土壤浸出物1 L，pH 7.2，121 ℃高压灭菌30 min。 国际链霉菌计划（international Streptomyces project， ISP）2培养基：葡萄糖4 g，CaCO3 2 g，麦芽抽提物10 g，酵 母抽提物4 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1 L，115 ℃高压灭菌 30 min。 改良的葡萄糖酵母麦芽（glucose yeast malt，GYM）链 霉素培养基：葡萄糖4 g，CaCO3 2 g，麦芽抽提物10 g，酵 母抽提物4 g，微量元素预混液0.5 mL，腐殖酸浸出液10 mL， 琼脂18 g，蒸馏水定容至1 L，115 ℃高压灭菌30 min。 GYM液体培养基：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麦芽提 取物10 g，蒸馏水定容至1 L，115 ℃高压灭菌30 min。 LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃高压灭菌30 min。LB固体培 养基：在LB液体培养基中加入琼脂20 g。

抗生素、抗菌药物储存液（重铬酸钾50 mg/L，制霉菌 素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放线菌酮50 mg/L）：德国 Sigma公司；酚、氯仿等脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid， DNA）提取试剂：北京索莱宝科技有限公司；乙酸乙酯、甲 醇（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；Ex Taq酶（5 U/μL）、 脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate， dNTP）Mixture、Taq Buffer等分子生物学试剂及酶类：宝 生物工程（大连）有限公司。

BSP-400培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公 司；E002092超级洁净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；Direct-Q5UV超纯水机：美国密理博公司；MLS3781L-PC自动蒸汽灭菌器：日本松下公司；T100快速梯度 PCR仪：美国伯乐公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统：美国 伯乐公司；DYCP-33A电泳仪：北京六一生物科技有限公司。

土壤样品预处理：每份样品分别称2 g于无菌研钵中， 加入0.2 g CaCO3，用无菌杵研磨成细粉，装入50 mL无菌离 心管中，28 ℃风干2周后，加入30 mL无菌水，置于28 ℃摇床 上150 r/min振荡1 h使土壤充分悬浮，55 ℃处理20 min，促 使放线菌孢子萌发。 菌株的分离纯化：采用梯度稀释法将土壤预混液分别 稀释成10-2 、10-3 和10-4 3个浓度梯度，振荡混匀，分别吸取不 同浓度梯度的土样悬浊液200 μL均匀涂布于4种放线菌分离培养基（改良高氏1号培养基、土壤浸汁腐殖酸培养基、 ISP2培养基、改良的GYM链霉素培养基）上，28 ℃静置培 养，随时观察培养基上的菌落生长状态，挑取目的菌株进 行分离纯化并保藏。

从采集的32份土样中共分离到169株放线菌菌株，其中赤水丹霞山土样65株（以CS命名菌株）、凤凰山公园土样 45株（以FHS命名菌株）、大板水国家森林公园土样59株 （以DBS命名菌株）。采用琼脂扩散法对分离菌株的抗MRSA 活性进行测定。不同分离菌株具有不同程度的抗MRSA 活性，且分离的169株菌株中有68株具有抗MRSA活性，占 总分离菌株的40.24%。因此，以68株活性抗MRSA菌株进 行后续的基因组勘探。同时Blast比对中，菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、 CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7与NCBI的GenBank数据库中已有菌株的16S rRNA 序列相似性＜98%，说明本地区土壤放线菌中可能蕴藏潜 在的较新颖菌株，具有开发的潜力。CHRISTIANSEN G等指出卤化酶基因、聚酮合酶基 因、非核糖体肽基因等可以作为指示基因对微生物产次级 代谢产物的潜力进行快速评估。利用微生物的基因组信息 预测其合成特定天然产物的潜能，进而进行新化合物分离 纯化和结构鉴定的基因组挖掘技术。

本研究从32份土样中共分离纯化到169株放线菌，其 中68株菌株具有抗MRSA活性，占总分离菌株的40.24%。通 过16S rRNA序列分析可知，68株活性菌株主要为链霉菌 属（Streptomycessp.），其中菌株DBS8-4、DBS8-13、CSGY1-11、 CSHG2-5、CSDG1-2、CSDG5-5、CSGY1-3、CSGY5-3、CSGY 1-9、FHS4-7 与 NCBI 的 Genbank 数 据 库 中 已 有 菌 株 的 16S rRNA序列相似性＜98%，说明本地区土壤放线菌中可 能蕴藏潜在的较新颖菌株，具有开发的潜力。 通过对68株活性菌株的次级代谢产物基因的勘探可 知，Hal阳性菌株占17.65%，PKS I阳性菌株占36.47%，PKS II 阳性菌株占61.77%，NRPS阳性菌株占32.35%，其中菌株 DBS9-1、DBS12-6、DBS8-13、DBS22-6、CSDG1-2、FHS5-10、 FHS10-22中同时含有NRPS或Hal、PKSI、PKSII三种基因， 本实验可为后续通过激活特定合成的基因组定向挖掘该 类化合物等研究提供参考。

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