鱼源荧光假单胞菌生物研究！！！

养殖鱼类低温贮藏品质下降的主要原因是嗜 冷腐败微生物的生长繁殖。 在有氧冷藏条件下，假 单胞菌多为淡水鱼的特定腐败菌。 胥亚夫等发现 水产品中主要腐败菌为假单胞菌属细菌， 包括荧 光 假 单 胞 菌、 腐臭假单胞菌和边缘假单胞菌 。 Parlapani 等报道海鲷中的腐败微生物为假单胞 菌属，特别是荧光假单胞菌。 杨宪时等研究罗非 鱼冷藏过程菌相的变化，发现在 0～10 ℃冷藏过程 中假单胞菌为优势腐败菌， 荧光假单胞菌为最优 势种群。 郭全友等对养殖大黄鱼的菌相研究中， 鉴定出腐败希瓦氏菌和假单胞菌是低温贮藏大黄 鱼的优势腐败菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PF01、PF06 和 PF07 为冷藏大黄鱼中的优势 腐败菌，PF10 为大菱鲆的特定腐败菌，NCBI 登录 号 分 别 为 KU173826 、 KU173831 、 KU173832 、 KR706375，PFuk4 为标准菌株， 购买于微生物菌种保藏中心。 LB 肉汤、胰酶大豆肉汤（TSB）、营养琼 脂（NA），泳动性培养基（胰蛋白胨 1%，NaCl 0.5%， 琼脂 0.3%）， 均购买于青岛海博生物有限公司； SYTO9，Thermofisher，Waltham，MA，USA；96 孔 细 胞培养板，无锡 NEST 生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD 超净工作台，苏净集团苏州安泰 空气技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；酶标仪 VICTOR X， 美 国 Perkin Elmer 公 司；移 液 器，德 国 Eppendorf 公司； 荧光显微镜 LEICA DM4000， 德国莱卡公 司。

1.3 方法

1.3.1 活化培养

将-80 ℃贮藏的 5 株荧光假单 胞菌甘油菌接种于 LB 培养基中 28 ℃，200 r/min 过夜活化后，于 LB 培养基中二次活化。 离心收集 菌体， 用无菌生理盐水将菌浓度调整到 108 CFU/ mL 待用。

1.3.2 生长曲线测定

将 5 株荧光假单胞菌分离 株过夜活化菌液稀 释 10 倍 后 按 1%接 种 于 含 有 200 μL TSB 培养基的 96 孔板中，置于 28 ℃下培 养，每隔 3 h 用酶标仪测定 600 nm 处吸光度。

1.3.3 结晶紫法定量检测生物被膜

将过夜活化 的 细 菌 菌 液 稀 释 10 倍 后 按 1%接 种 量 接 种 于 TSB 培养基， 并以 200 μL 分装到 96 孔板中，28 ℃静置培养 3，6，9，12，18，24 h 后， 采用结晶紫法 测定生物被膜形成量。 根据 Djordjevic方法略做 修改，去除孔板中菌液，每孔用 250 μL PBS 缓冲 液轻轻漂洗 3 次，干燥后，加入 200 μL 0.2%的结 晶 紫 溶 液，染 色 15 min 后 清 洗，干 燥，最 后 加 入 200 μL 33%冰乙酸， 用酶标仪测量其 590 nm 处 吸光值。

1.3.4 胞 外 多 糖 （EPS） 含 量 测 定

参 考 Harimawan 等的方法略作修改提取胞外多糖。 具体 为培养 12，18，24 h 后的 10 mL 菌液，4 ℃离心（5 000×G，20 min）， 去 上 清 ， 然 后 用 磷 酸 缓 冲 液 （Phosphate Buffered Saline，PBS）重悬菌体，在 80 ℃水浴 30 min，4 ℃离心 （15 000×G，30 min），用 0.22 μm 滤膜过滤，得到上清液用苯酚硫酸法测定 胞外多糖含量。

1.3.5 珠涡流法

在 1.3.1 节所述的细菌菌悬液中加入不锈钢片 （10 mm ×10 mm） 和盖玻片（22 mm × 22 mm）。在 28 ℃静置培养 1 h。参考 Nguyen 等珠涡流法对粘附在不锈钢片表面的细菌进行 计数。具体方法如下，用 PBS 缓冲液轻轻洗去不锈 钢片表面的浮游菌， 然后放于装有 10 mL 无菌生 理盐水的离心管中，加入适量玻璃珠，剧烈涡旋 3 min 后，梯度稀释计数。

1.3.6 荧光显微镜观察

荧光显微镜观察参照 Bagge 等的方法。 具体如下：用灭菌 PBS 洗去盖 玻片上浮游菌， 放入 2.5%的戊二醛中固定 1.5 h， 用 PBS 洗去戊二醛，烘箱干燥后，滴加 70 μL 0.1 μL/mL SYTO9 于盖玻片上， 均匀覆盖于表面，避 光孵育 20 min，吸去多余的染料后，放置荧光显微 镜下（40×）观察。

1.3.7 泳动性测定

参考 Sperandio 等的方法， 泳动琼脂培养基凝固后，将 5 μL 过夜培养的菌液 滴在平板中心，吸干后，移至 28 ℃培养箱中静置 培养 24 h。

1.3.8 蛋白酶活性测定

参照 SB/T 10317-1999 标准中福林酚法测定蛋白酶活力方法，在 40 ℃ 下每分钟水解酪蛋白产生 1 μg 定义为 1 个蛋白 酶活力单位。

1.3.9 嗜铁素检测

参考文献，制作 CASAD 嗜铁素检测平板，利用 CASAD 嗜铁素平板法可检 测总的嗜铁素， 将过夜培养的菌液离心取上清 5 μL 加入平板中，置于 28 ℃培养 24 h 后观察。

1.3.10 生 物 报 告 菌 检 测

信 号 分 子 参 考 Ravn 等方法并略作修改。 报告菌紫杆菌 CV026 活化 后，取 5 mL 加入到 50 mL LB 琼脂中，混合均匀后 倒平板，待冷却后，平板中心打 孔，加 入 菌 液，28 ℃培养，观察颜色变化。

1.3.11 统计学处理

每组样品设 3 个重复，结果 取其平均值。采用 Microsoft Excel 和 Origin 8.5 进 行数据处理和 作图， 并利用 SPSS21.0 的 ANOVA 进 行 方 差 分 析 P<0.05 表示有统计学意 义。

2 结果与分析

研究测定了 5 株荧光假单胞菌分离株在 28 ℃下静置培养的生长曲线。 如图 1 所示，荧光假单胞菌在 3 h 到 12 h 期间生长迅速，尤其是 PF07 在 对数生长期生长最快，PF01、PF06 和 PF10 次之， 且这 3 株菌的生长基本保持一致，PFuk4 生长最慢。 在 18 h 后 PF07 和 PFuk4 生长缓慢，在培养 24 h 进 入稳定期，而其余 3 株菌依然在逐渐增长，在 27 h 进入稳定期。 PF01、PF06、PF07、PF10 和PFuk4 5 株菌在稳定期的细菌量分别达到 1.7，1.7，1.5，1.7 和 1.4（OD600），其中 PF01、PF06 和 PF10 的细菌量 最高，PFuk4 的菌量最少。

荧光假单胞菌在 96 孔塑料孔板上也能形成 被膜， 其中培养 3 h 时 5 株菌的生物被膜量基本 保持一致（P>0.05）。 随着细菌生长，荧光假单胞菌 的生物被膜量也开始显著增加 ， 培 养 至 12 h， PF01、PF06、PF07 和 PF10 的 生 物 被 膜 量 达 到 最 高，分别为 1.71，1.72，2.24 和 1.61（OD600），而 PFuk4 在 18 h 达到最高，为 2.50，随即又开始下降。 在荧 光假单胞菌分离株中 PF07 和 PFuk4 的生物被膜形 成能力较强，且 PF07 被膜形成周期较短。 研究表 明，荧光假单胞菌具有较强的生物被膜能力，而且 不同来源的荧光假单胞菌生物被膜形成能力差别 较大。 Sim觛es 等报道荧光假单胞菌模式菌株形 成生物被膜的能力高于从乳制品加工环境中分离 得到的分离株。 课题组也发现不同来源的铜绿 假单胞菌形成生物被膜的能力也有所不同。 在食 品接触表面的腐败致病菌的粘附及生物被膜形 成，增加产品加工过程的交叉污染，缩短货架期， 给食品产业带来严峻挑战。

3 结论

研究表明，5 株荧光假单胞菌都能在试管和 塑料孔板中形成大量生物被膜， 且能较快地粘附 于不锈钢片与玻璃片表面。 荧光假单胞菌具有较 强的泳动性、蛋白酶活性及产嗜铁素，其中 PF07 较强的生物被膜形成能力和致腐表型， 可能与高 活性的 AHLs 存在内在关联。