灭菌锅在神经细胞PC12毒性的分析

长期接触砷是一种普遍的威胁人类健康的环 境健康问题，高浓度的砷会对神经系统产生毒性， 急性暴露在高浓度的砷环境会导致机体产生轻微 持久的周围神经病变，慢性暴露会导致感官缺陷和 神经系统功能损伤。人参皂苷 Rb1( ginsenoside Rb1) 是中药人参的主要有效成分之一，具有抗衰 老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等功效。研 究显示，人参皂苷 Rb1 对中枢神经系统的调节起着 重要作用，通过促进神经元细胞周围突触的生长起 到保护神经元的作用。但人参皂苷 Rb1 对砷损 伤神经细胞的保护机制尚未明确。本研究旨在基 于 AKT /GSK-3β /NFAT 途径探讨人参皂苷 Rb1 对 砷诱导的神经细胞———嗜铬细胞瘤细胞( pheochromocytoma cell，PC12) 毒性的抑制作用及作用机制。

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 PC12 细胞，购买 于中国科学院上海生命科学研究院细胞中心。 人参皂苷 Rb1 购买自南京春秋生物工程有限 公司( 纯度≥98%) 。DMEM 培养液( 美国 Sigma 公 司) ; 新生牛血清( 美国 Gibco 公司) ; 噻唑蓝( methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) ( 美国 Hyclone 公司) ; 胰 蛋白酶( 美国 Amresco 公司) ; RIPA 裂解液( 美国 Amresco 公司) ; DCFH-DA( 2'，7'-二氯四氟乙烷双乙 酸盐) 、活性氧( reactive oxygen species，ROS) 检测试 剂盒( 碧云天生物技术研究所) ; 蛋白激酶 B( protein kinase B，AKT ) 、糖 原 合 成 酶 激 酶 3β ( glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β) 、活 化 T 细 胞 核 因 子 ( nuclear factor of activated T cell，NFAT) 、B 淋巴细 胞瘤 2 蛋白( B-cell lymphoma-2，Bcl-2) 、Bcl-2 相关 X 蛋白( Bcl-2 associated X protein，Bax) 、半胱氨酸蛋 白酶 3( Caspase-3) 、β-actin 一抗( 美国 Santa 公司) ; WB 试剂盒购自赛默飞世尔科技( 中国) 有限公司;其他试剂均为化学分析纯。

电子分析天平( 上海梅特勒-托利多有限公司， 型号 AR2130) ; 离心机( 长沙湘智离心机仪器有限 公司，型号 TD5B) ; 超净工作台( 济南来宝医疗器械 有限公司，型号 BBS-DDC) ; 细胞计数器( 美国 Nexcelom Bioscience LLC 公司) ; 恒温细胞培养箱( 德国 Heraeus 公司，型号 HERAcell) ; 高压灭菌锅( 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号 BXM-50VD) ; 酶标仪( 美国 NanoDrop 公司) ; 倒置相差显微镜( 日 本 Olympus 公司，型号 IX81) ; 细胞培养板/皿、离心 管、EP 管 ( eppendorf 管) 、冻 存 管、无 菌 镊 ( 美 国 Costar 公司) ; 流式细胞仪( 美国 Beckman Coulter 公 司) ; 超 低 温 冰 箱 ( 日 本 Sanyo 公 司，型 号 MDF382E) ; 电热恒温水浴箱 ( 德 国 HETO 公 司) ; Western blot 蛋 白 显 影 仪 ( 美 国 Protein Simple 公 司) 。

采用 DMEM 培养液( 含 10%胎牛血清+100 kU/ L 青霉素+100 mg /L 链霉素) 在 37 ℃、5%CO2、饱和 湿度的 条 件 下 培 养 PC12 细 胞，每 隔 2 天 更 换 DMEM 培 养 液，取对数生长期的细胞进行后续 实验。

取对数生长期的 PC12 细胞，用 DMEM 培养液 调节细胞浓度为 1×109 /L，接种于 96 孔培养板中， 置于 5%CO2、37 ℃培养箱中培养 24 h。每孔加入不 同浓度( 0、2. 5、5、10、15、20、50 μmol /L) 硫化砷( arsenic sulfide) ，每个浓度重复 3 孔，以二甲基亚砜 ( dimethyl sulfoxide，DMSO) 为 空 白 对 照，培 养 24、 48、72 h 后，每孔加入 5 g /L MTT 溶液 20 μL，37 ℃ 孵育 4 h。弃去上清液，少量 DMEM 培养液洗涤 2 ～ 3 次后加 DMSO 100 μL 溶解晶体，用振荡器摇匀， 使沉淀充分溶解后，使用酶标仪在 570 nm 波长处测 得各孔吸光度( absorbance，A) 值，依据下列公式计PC12 细 胞 的 增 殖 率: 细 胞 增 殖 率 = 实 验 组 A570 nm /对照组 A570 nm ×100%。

给予不同浓度硫化砷处理 PC12 细胞 24、48、72 h 后，对照组细胞排列紧密，细胞有活力; 硫化砷干 预后细胞出现皱缩，活性降低，且随着硫化砷浓度 的增加损伤更为显著; 随着作用时间的延长，细胞 的活性降低加剧，细胞之间的连接逐渐稀疏。5、10、20 μmol /L 人 参 皂 苷 Rb1 分 别 与 20 μmol /L 硫化砷共同处理 PC12 细胞 24 h，A 值随着 人参皂 苷 Rb1 浓度的改变逐渐发生变化，表 明 PC12 细胞的增殖能力发生了不同程度的变化，人参 皂苷 Rb1 对硫化砷损伤的 PC12 细胞有保护作用， 且其保护作用与药物浓度呈现一定的依赖性。5、10、20 μmol /L 人 参 皂 苷 Rb1 分 别 与 20 μmol /L 硫化砷共同处理 PC12 细胞 24 h，与对照组 相比，20 μmol /L 硫化砷组 PC12 细胞的凋亡率明显 上升; 与 20 μmol /L 硫化砷组相比，人参皂苷 Rb1 组 PC12 细胞的凋亡率明显降低，说明人参皂苷 Rb1 可有效抑制硫化砷诱导的 PC12 细胞的凋亡，并且 呈现药物浓度依赖性。5、10、20 μmol /L 人 参 皂 苷 Rb1 分 别 与 20 μmol /L 硫化砷共同处理 PC12 细胞 24 h，与对照组 相比，20 μmol /L 硫化砷组 PC12 细胞内 ROS 的含 量明显增多; 与 20 μmol /L 硫化砷组相比，人参皂苷 Rb1 组 PC12 细胞的 ROS 含量明显降低，并且呈现 药物浓度依赖性。

人参皂苷 Rb1 是人参二醇系皂苷的主要代表 成分之一，对中枢神经系统的调节起着重要作用。 有研究报道，采用人参皂苷 Rb1 治疗皮质神经细胞 受到氧自由基损伤的大鼠，结果神经细胞抗自由基 的能力增强，缓解了神经元细胞的损伤，起到保护 神经细胞的作用。另外，人参皂苷 Rb1 还能通过 改变胞膜的流动性缓解神经细胞老化，它可以促进 细胞内蛋白质的合成，使细胞生物膜维持在稳定状 态，达到保护神经元的作用。