恒温培养箱对于细菌检测不确定度的评定的应用

在油田注入水的检测系统中，细菌检测是重要 指标。油田注水系统中，腐蚀性细菌造成金属腐蚀， 管路堵塞，进而导致注水压力逐年提高，地层压力 逐步降低，严重影响油田正常生产。细菌检测结果的准确性，对指导油田生产具有重要作用。在 《SY/T 0532-2012 油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》 中，推荐对铁细菌、硫酸盐还原菌和腐生菌这三种 注水常见危害细菌采用绝迹稀释法进行测定。

95%乙醇（分析纯），脱脂棉，1 mL 注射器（0.02 mL 分度），上海博迅 BPX-272 电热恒温培养箱，沃特 KBC 系列细菌测试瓶。

根据需要对铁细菌、硫酸盐还原菌和腐生菌分 别进行单组测试和多组测试。多组实验用五个装有 相应菌类培养基测试瓶依次标号。 用酒精棉球对手及开盖后的测试瓶进行消毒； 用无菌注射器吸取 1 mL 水样注入测试瓶中，摇匀； 另取无菌注射器，从一号瓶吸取 1 mL 水样注入二号瓶，摇匀；依次操作至最后一个样品瓶为止。放 入 35 ℃恒温培养箱中培养。培养硫酸盐还原菌 14 天观察，测试瓶中液体由无色变为黑色，即为阳性 结果。培养腐生菌 7 天后观察，液体由红变黄或浑 浊，为阳性结果。培养铁细菌 7 天后观察，测试瓶 中液体产生浑浊或红棕色沉淀，为阳性结果。

根据重复次数（测试组数)的每级结果查《SY/T 0532-2012 油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》 附表附录，乘以相应的级数得出检测结果。

测量不确定度的来源包括 A 类不确定度和 B 类 不确定度。用统计分析的方法对规定测量条件下测 得的量值进行测量不确定度分量评定的方法为 A 类 不确定度；基于量值、仪器准确度、校准记录等方 法评定的不确定度为 B 类不确定度。经分析，绝迹 稀释法结果不确定度的来源主要是取样和结果重复 性引入的不确定度。其中属于 A 类不确定度的为结 果重复性引入的不确定度，属于 B 类不确定度的为 取样 1 mL 引入的不确定度。

样品的梯度稀释采用 1 mL 玻璃注射器，进行 反复 5 次吸取注射。根据玻璃量器规定，1 mL 玻璃 注射器（A 级）允差为±0.008。其标准不确定度 0.008/√3=0.004 6。在 5 次使用过程中产生的不确定 度为√5 ൈ 0.004 6ଶ=0.010 3。在室温 25 ℃操作时， 根据水的膨胀系数，5 次使用过程中产生的不确定度为 5×5×2.1×10-4÷√3=0.003 0。则梯度稀释过 程产生的不确定度 U 稀 =√ 0.010 3ଶ ൅ 0.003ଶ =0.0107。取样时引入的相对 标准不确定度为 Urel(稀)= 0.010 7/5=0.002 1。

（1）绝迹稀释法是结合了微生物学和统计学的 一种定量检测法。待测样品经稀释培养后，根据生 长的最高稀释浓度和最低稀释浓度，应用泊松分布 计算出样品最大可能数。绝迹稀释法所得到结果本 身就包括了一定的概率。但是在实际操作过程中， 吸取溶液等操作步骤都会另外带入不确定度。因此需对整个过程进行不确定度评价。

（2）影响整个过程的不确定度因素很多，除了 上述不确定度之外，还有样品保存引起的不确定度， 检测环境引起的不确定度，细菌瓶的质量引起的不 确定度，恒温培养箱培养过程中的不确定度，人员 读数引起的不确定度。它们对合成不确定度的贡献 较小，所以在此次评定过程中没有计入上述因素。

（3）细菌是以几何速度增殖，所以不确定度评 定过程按取对数计算比较合理。

（4）在 A 类不确定度和 B 类不确定度同时评 定时，仪器分辨力引入的不确定度和重复性引入的 不确定度之间，应取其大者。